Dirofilaria immitis přenášená komárem Dirofilaria immitis u psů z Austrálie

vzorky

testované vzorky zahrnovaly dvě kohorty. První kohorta, vzorky (FVS-CN, n = 39) byly od těch, které byly pozitivně testovány pomocí klinických antigenních testů. Druhá kohorta, vzorky (FVS-HW, n = 2) byly z nedávných klinických případů, které jsou v současné době léčeny na psí dirofilárii na Fakultě veterinárních věd Univerzity v Sydney.

vzorky krve FVS-CN#1 až FVS-CN # 39 byly odebrány v dubnu až červnu 2015 od psů v Queenslandu v Austrálii (Tabulka 1). Psi se nacházeli v oblasti Mackay (FVS-CN#1, FVS-CN#3 až FVS-CN # 34, FVS-CN # 36 až FVS-CN#39), Cairns (FVS-CN#2) a Toowoomba (FVS-CN#35) (Doplňkový soubor 1: tabulka S1). Všechny vzorky byly původně pozitivně testovány pomocí in-clinic Witness Dirofilaria® (Zoetis, Austrálie), což je test rychlé Imunomigrace (RIM®) pro detekci antigenu dospělé samice d. immitis (heartworm) u psů pozitivních veterinárními lékaři. Pro potvrzení výsledku jsme provedli DiroCHEK® (Zoetis, Austrálie prostřednictvím Vetpath Laboratory Services, Západní Austrálie) enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA) pro detekci dospělého antigenu D.immitis a Knottův test (Vetpath Laboratory Services, Západní Austrálie). Pro každého psa pouze lokalita, věk, přítomnost podezření na dirofilárii související klinické příznaky a anamnéza prevence dirofilárií byly k dispozici. Dodržování prevence dirofilárií bylo hlášeno jako „přísné“, pokud klient uvedl celoroční podávání vhodného přípravku (nebyly poskytnuty žádné skutečné důkazy o nákupu a podání), „nekonzistentní“, pokud byly vynechány prevence dirofilárií nebo přerušovaně podávány nebo podány nesprávné dávky, a „neznámé“, pokud takové informace nebyly k dispozici nebo nebyly známy. Anonymní vzorky chlazené krve FVS-CN#1 až FVS-CN # 39 byly zpracovány na Fakultě veterinárních věd University of Sydney pro tuto studii(další soubor 1: tabulka S1).

Tabulka 1 souhrn diagnostiky Dirofilaria immitis (Dirofilaria immitis) u psů z Austrálie

dva nedávné (Únor, 2016) vzorky krve psa pozitivní na mikrofilárii poskytly Univerzitní Veterinární Fakultní nemocnice v Sydney (UVTHS), Fakulta veterinárních věd, University of Sydney. Oba psi měli dříve bydliště v Queenslandu, Austrálie. U FVS-HW#1 (1 300 mikrofilárií/ml) a FVS-HW#2 (14 mikrofilárií/ml) byla koncentrace mikrofilárie hodnocena pomocí mikrokapilárního testu. Stručně řečeno, buffy coat byl pozorován na přítomnost mikrofilarie pod mikroskopem v mikrohematokritových zkumavkách po centrifugaci krve EDTA. Pozitivita FVS-HW#1 byla také hodnocena modifikovaným Knottovým testem. Pes FVS-HW#1 byl před léčbou označován jako UVTHS pro onemocnění dirofilárií, krev byla odebrána a testována pozitivně pomocí testovací sady Anigen Rapid Canine Heartworm (CHW) AG 2.0 (Bionote; Life Bioscience, Oakleigh, Austrálie) chromatografický imunotest pro kvalitativní detekci antigenu psích D. immitis; pes zůstal v Mackay, Queensland před příjezdem do Sydney, Nový Jižní Wales. Pes FVS-HW#2 podstoupil léčbu dirofilárií melarsominem (Immiticide®, Merial) a krev byla odebrána před druhou léčbou, v době, kdy byla krev FVS-HW#2 negativní pomocí testovací sady Anigen Rapid Canine Heartworm (CHW) AG 2.0; pes pocházel z Brisbane v Queenslandu, ale byl znovu upraven odjinud (neznámý zdroj)v Queenslandu. U FVS-HW#1 i FVS-HW#2 byla prevence dirofilárií přerušovaná. Kromě toho byla do studie zahrnuta Psí DNA izolovaná od psa s bydlištěm v Nadi na Fidži (Fidži-HW#1) z roku 2009 jako počáteční pozitivní kontrola.

izolace a potvrzení DNA Psí krve

vzorky krve (EDTA, 70-200 µl) z FVS-CN#1 do FVS-CN#39 byly zmrazeny po dobu 8-10 měsíců při -20 °C a pro izolaci DNA byla použita chlazená krev (200 µl) z FVS-HW#1 a FVS-HW#2. Genomická DNA ze vzorků FVS-CN#7 až FVS-CN # 39, FVS-HW#1 a FVS-HW#2 byla izolována pomocí kombinace Mobio PowerMag® Blood Isolation Kit (lysis) a PowerMag® Microbiome RNA / DNA Isolation Kit (magnetic separation) (Mo-Bio Laboratories; GeneWorks, Thebarton, Austrálie) optimalizované pro KingFisher® Duo (Thermo-Fisher Scientific, Scoresby, Austrálie). Izolace byla zpracována v dávkách 11 vzorky krve a extrakční prázdné. Počáteční lýza byla podle izolační části krevní soupravy s modifikací kroku lýzy bílých krvinek (650 µl lyzátu červených krvinek a 450 µl roztoku lýzy PowerMag® WBC). Izolace DNA byla zpracována 700 µl supernatantu WBC v destičce KingFisher® Microtiter Deep Well 96, jak navrhuje protokol Microbiome kit. Vzorky byly eluovány v 70 µl vody bez Rnázy ClearMag®. Genomická DNA ze vzorků FVS-CN#1 až FVS-CN#6 byla izolována pomocí sady krevní DNA Isolate II (BioLine, Austrálie) a eluována ve 100 µl Tris pufru (pH = 8) podle protokolu výrobce. Koncentrace DNA byly stanoveny spektrofotometrem NanoDrop 1000 (Thermo-Fisher Scientific, Scoresby, Austrálie). DNA byla uchovávána v alikvotech při -20 °C až do dalšího použití.

Buffy coat s 1-2 mikrofilariemi z FVS-HW#2 byl odebrán pomocí tuberkulinové stříkačky a jehly z mikrohematokritové zkumavky po centrifugaci. DNA byla izolována pomocí souprav MoBio na Ledňáčkovi, jak je popsáno výše.

k ověření přítomnosti Psí DNA jsme použili PCR v reálném čase k amplifikaci parciálního (276 bp) psího ß-aktinu, primerů (S0588) aktinu F2: 5′-ACC ACT GGT ATT GTC ATG GAC TCT G-3′ a (S0589) aktinu R2: 5′-GCT CTT CTC CAG GGA GGA CGA-3′ . Podmínky cyklování PCR zahrnovaly počáteční krok při 95 °C po dobu 3 minut, následovaný 40 dvoustupňovými cykly při 95 ° C po dobu 5 s a 60 °C po dobu 15 s. Reakční směs PCR v reálném čase (20 µl) obsahovala 10 µl sady SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline, Eveleigh, Austrálie), každý primer v koncentracích 400 nM, vodu třídy PCR a 2 µl šablony DNA. PCR v reálném čase byla provedena na detekčním systému PCR v reálném čase CFX96 Touch™ s odpovídajícím softwarem CFX Manager v. 3.1 (BioRad, Gladesville, Austrálie). Libovolná prahová hodnota PCR v reálném čase byla stanovena automaticky pomocí výchozích nastavení a hlášených hodnot Ct.

filarioidy přenášené členovci v reálném čase PCR

test s vysokým rozlišením taveniny (HRM) v reálném čase byl proveden pomocí primerů navržených Wongkamchai et al. pro detekci Dirofilaria immitis, Brugia malayi a B.pahangi ve vzorcích krve. Primery (S0579) (F: 5′ – TTT AAA CCG AAA AAA Tat TGA CTG AC-3′) a (S0580) (R: 5′ – AAA AAC TAA ACA ATC ATA CAT GTG CC-3′) se zaměřují na přibližně 110-120 bp dlouhou částečnou sekvenci filarioidní mitochondriální 12s rRNA genu. Test je schopen amplifikovat potenciálně všechny druhy filariálních hlístic . Reakční směs PCR v reálném čase (20 µl) obsahovala 10 µl směsi SensiFAST HRM mix (Biolin), každý primer v koncentracích 400 nM, 4,4 µl vody třídy PCR a 4 µl šablony DNA. Pozitivní kontrolní plazmidy s DNA pro Gen rRNA D. immitis a Acanthocheilonema reconditum 12S byly syntetizovány společností GeneArt (Thermo-Fisher Scientific, Scoresby, Austrálie).

pro optimalizaci podmínek s SensiFAST HRM mix (BioLine, Austrálie) byla účinnost PCR v reálném čase hodnocena přes tepelný gradient od 59 °C do 62 °C proti desetinásobným sériovým ředěním (v rozmezí od 1,96 × 105 do 1.96 × 100 kopií na reakci) známé koncentrace plazmidové DNA obsahující Gen rRNA D. immitis 12S analyzovaný ve trojím vyhotovení. Reakční podmínky byly nastaveny s počátečním aktivačním krokem polymerázy při 95 °C po dobu 3 minut, následovaným 40 dvoustupňovými cykly při 95 °C po dobu 5 s a 59 °C až 62 ° C po dobu 15 s. cyklus HRM byl nastaven mezi 60 °C a 90 °C, s přírůstky v intervalech 0,2 °C. PCR v reálném čase byla provedena na detekčním systému PCR v reálném čase CFX96 Touch™ s odpovídajícím softwarem CFX Manager v. 3.1 (BioRad, Austrálie). Pro každý vzorek CFX Manager v. 3.1 hlášené Ct-hodnoty a čísla kopírování na základě standardní křivky pozitivní kontroly. Libovolná prahová hodnota PCR v reálném čase byla nastavena na jediný práh při 100 rfu. Pro vykreslení normalizované křivky klesající fluorescence se zvyšující se teplotou byl použit software Precision Melt v. 1.2 (Bio-Rad, Austrálie). Každý běh zahrnoval alespoň jednu negativní kontrolu (NTC, necílové řízení).

optimalizovaný filariální 12s rRNA gen v reálném čase PCR byl spuštěn jako výše s teplotou žíhání nastavenou na 62 °C s reakční účinností (90-110 %) a limitem detekce určeným jako větší nebo roven 196 genovým kopiím 12s rRNA genu na reakci. Optimalizovaná PCR v reálném čase byla použita ke kvantifikaci koncentrací mikrofilárií ve vzorcích krve a vzorku FVS-HW#2 (1 300 mikrofilárií/ml) použitých ke kalibraci konverze na mikrofilárie pro každý vzorek (další soubor 1: tabulka S1). Každý běh PCR v reálném čase zahrnoval duplicitní sériová ředění plazmidové DNA (D. immitis, a. reconditum plasmids). Všechny vzorky DNA byly provedeny jednou. Pokud byly vráceny žádné nebo > 35 Ct-hodnoty (negativní vzorky a pozdní zesilovače), reakce byly znovu spuštěny. Všechny vzorky s hodnotami < 35 Ct byly odeslány pro čištění DNA a následné sekvenování DNA pomocí amplifikačních primerů v Macrogen Inc. (Soul, Korea). Pro vytvoření normalizovaných křivek tání a rozdílových křivek tání byly stanoveny oblasti normalizace taveniny před (70-71 °C) a po (76-77 °C) tak, aby definovaly hlavní teplotní hranice normalizovaných a rozdílových grafů. Software Precision Melt v. 1.2 Poté přiřaďte každý vzorek clusteru pomocí výchozího nastavení.

specifická PCR Dirofilaria immitis v reálném čase

pro detekci D. immitis byl proveden test PCR v reálném čase pomocí primerů navržených Rishniwem a kol. a aplikován Rojas et al. . Primery (S0582) (F: 5′-AGT GTA GAG GGT CAG CCT GAG TTA-3′) a (S0583) (R: 5′-ACA GGC ACT GAC AAT ACC AAT-3′) se specificky zaměřují na fragment genu cox1 (~203 bp) pro D.immitis. Reakční směs PCR v reálném čase (20 µl) obsahovala 10 µl sady SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline, Austrálie), každý primer v koncentracích 400 nM, 4,4 µl vody třídy PCR a 4 µl šablony DNA. Nejprve byl proveden test PCR s tepelným gradientem od 59 °C do 62 °C pro stanovení optimálních teplot žíhání pro pár primerů pomocí sady SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline, Austrálie). Reakce byla provedena s trojnásobným desetinásobným sériovým ředěním (1,96 × 102 až 1,96 × 107 kopií na reakci) známé koncentrace plazmidové DNA obsahující D. immitis cox1 Gen syntetizovaný společností GeneArt (Thermo Fisher, Austrálie) a s negativními (bez šablony) kontrolami. Amplifikace byla provedena následovně: počáteční denaturační krok při 95 °C po dobu 3 minut, následovalo 40 cyklů denaturace (5 s při 95 °C), žíhání (15 s od 59 ° C do 62 °C). Konečná křivka tavení byla vytvořena zahříváním produktu z 60 °C na 90 °C po dobu 5 s při krocích po 0,5 °C. Test PCR v reálném čase byl proveden na detekčním systému PCR CFX95 Touch™ v reálném čase (BioRad Laboratories, Inc., Austrálie). Hodnoty prahového cyklu (Ct) a standardní křivka byly stanoveny CFX Manager ™ Software v. 3.1 (Bio-Rad). Žíhací teplota 62 °C byla shledána optimální a použita při následných amplifikačních reakcích.

konečný optimalizovaný průběh PCR v reálném čase sestával ze vzorků FVS-CN#1 až FVS-CN # 39, kontroly bez šablony a necílové kontroly s dalšími duplicitními desetinásobnými sériovými ředěními PLAZMIDOVÉ DNA (1,96 × 107 až 1,96 × 102 kopií na reakci) pro posouzení citlivosti. Optimalizovaná PCR v reálném čase zahrnovala teplotu žíhání nastavenou na 62 °C s reakční účinností (90-110 %) a limit detekce stanovený na ≥ 196 kopií genu cox1 na reakci. Pomocí softwaru CFX Manager ™ Verze 3.1 (Bio-Rad) byly stanoveny hodnoty Ct a vytvořena standardní křivka pro vyhodnocení účinnosti testu. Vzorky, které byly amplifikovány hodnotami Ct, byly odeslány k čištění a sekvenování DNA v Macrogen Inc. (Soul, Korea).

charakterizace sekvence lokusu Dirofilaria immitis P-glykoproteinu

pro získání PCR ampliconů lokusu P-glykoproteinu d. immitis (P-gp) původně jsme použili DNA přímo izolovanou z krevní PCR. Pro zlepšení úspěchu amplifikace P-gp jsme pak použili celý krok amplifikace genomu DNA izolované z krve. Amplifikace celého genomu (WGA) byla provedena pomocí sady pro amplifikaci dna illustra GenomiPhi V2 (GE Healthcare, Parramatta, Austrálie) za použití 1 µl gDNA extrahované ze Psí krve. Pro WGA jsme se primárně zaměřili na vzorky DNA s hlášeným přísným dodržováním preventivních opatření proti dirofiláriím (Tabulka 1). Amplifikace fragmentu P-pg byla provedena párem primerů, Pgp1sens (S0592) (5′-GGA CAA TTA TCC GGT GGT CA-3′) a Pgp1antisens (S0593) (5′ – TCG CAA ATT TCC TCC CAC TT-3′). Všechny PCR amplifikace byly provedeny pomocí MyTaq™ Red Mix (BioLine, Austrálie). Primery byly přidány v konečné koncentraci 0,25 µM každý. Konečný reakční objem 25 µl pro první PCR byl proveden za použití následujících cyklických podmínek: 95 °C po dobu 15 s, 56 °C po dobu 5 s a 72 °C po dobu 15 s po dobu 35 cyklů s 2 µl izolované DNA nebo 2 µl zředěním genomifi amplifikované DNA v poměru 1:50. Všechny reakce byly zahájeny při 95 °C po dobu 5 minut a ukončeny 72 °C po dobu 5 minut. PCR byly provozovány v Cykleru Veriti PCR (Life Sciences, Austrálie) spolu se sterilní vodou třídy PCR jako negativní kontrola. Výsledné produkty byly rozpuštěny v 1,5 % (w/v) agarózovém gelu. PCR byly provozovány v Cykleru Veriti PCR (Life Sciences, Austrálie) spolu se sterilní vodou třídy PCR jako negativní kontrola. Výsledné produkty byly rozpuštěny v 1,5 % (w/v) agarózovém gelu. PCR produkty byly přímo sekvenovány pomocí amplifikačních primerů ve společnosti Macrogen Ltd. (Soul, Korea). Sekvence byly sestaveny, zarovnány s referenční sekvencí lokusů divokého typu P-gp (HM596853) a/nebo analyzovány výbuchem pomocí hlavní pracovní plochy CLC 6.9.1 (CLC bio, Dánsko).

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.