5 Hacks De FlowJo Para Mejorar La Calidad De Su Análisis De Citometría De Flujo

El análisis de datos primarios, es decir, el análisis a nivel de muestra o tubo, es donde se identifican las poblaciones de interés y se extraen los datos necesarios para el análisis secundario. Desde la creación del estándar FCS, los citometristas de flujo han tenido la capacidad de analizar datos en software de terceros debido al acuerdo de la comunidad sobre el estándar. El estándar más reciente de FCS3.1. El estándar FCS divide el archivo en dos componentes, el archivo listmode que contiene los datos secuenciales de todos los detectores. El archivo de cabecera contiene lo que se denomina «palabras clave». Estos incluyen definir palabras clave que se agregan al archivo automáticamente, así como términos que el usuario puede definir.

Estas palabras clave son solo la punta del iceberg cuando se trata de realizar análisis avanzados. Este artículo se centrará en el poder de FlowJoX (FJX) y proporcionará algunos consejos y trucos para mejorar el análisis de los investigadores.

Incrustación y uso de palabras clave.

La información del encabezado del archivo FCS contiene una gran cantidad de información que es muy útil para revisar y extraer al realizar el control de calidad o la solución de problemas. Esta información está a solo un clic derecho en FJX.

Figura 1: Acceso a la información del encabezado FCS en FJX

La salida de esta acción se muestra en la figura 2.

Figura 2: Información del archivo de encabezado.

A la izquierda hay una lista de todas las palabras clave que están en el archivo, desde el instrumento en el que se adquirieron los datos hasta quién los adquirió y más. Cualquier palabra clave personalizada definida también aparecerá aquí. De hecho, es muy recomendable agregar palabras clave al configurar la adquisición de archivos en el instrumento. De esta manera se le asegura que las palabras clave correctas se llevan adelante. Esto puede ser muy útil para ordenar y analizar los datos más adelante.

En la parte superior derecha hay una lista de los parámetros, incluida la tensión en la que se ejecutó cada parámetro. Finalmente, la parte inferior derecha tiene un gráfico de la mediana de cada parámetro a lo largo del tiempo, que es útil para identificar si hubo problemas importantes en la adquisición, pero más sobre eso más adelante.

Si no agregaste palabras clave al principio de tu experimento, no te desesperes. Aún puede agregar palabras clave fácilmente en FJX utilizando la opción de palabras clave, que se puede encontrar en la cinta de FlowJo, como se muestra en la figura 3

Figura 3: Adición de palabras clave durante el análisis.

En este ejemplo, estamos agregando la concentración de palabras clave a este archivo que contiene datos de titulación. Después de seleccionar «Aceptar», se agrega la palabra clave y aparecerá en el espacio de trabajo de ejemplo, donde puede rellenar la palabra clave adecuada. Las palabras clave también se pueden agregar de la cinta del espacio de trabajo, que también le permite crear una serie de valores de palabras clave, lo que facilita el etiquetado de la palabra clave. Los resultados de agregar los valores de concentración como una nueva palabra clave se muestran en la figura 4.

Figura 4: Concentración añadida usando la palabra clave.

Una cosa común que se hace con los datos de valoración es la generación de un archivo concatenado de todos los datos para que pueda mostrarse en un solo gráfico bivariado. En la Figura 5, los datos se clasificaron por concentración de baja a alta, o de alta a baja, y los datos se concatenaron.

Figura 5: Ordenar los datos antes de la concatenación.

Dado que los datos se pueden ordenar utilizando la palabra clave, esto permite una clasificación/organización compleja de los datos. . Digamos que tiene palabras clave para el tiempo de tratamiento (0 horas, 4 horas, 20 horas), el tipo de tratamiento (sin estimulación, estimulación 1, estimulación 2) y la muestra (PBMC, BM), puede realizar una clasificación compleja para organizar los datos de una manera que facilite el análisis.

Las palabras clave ofrecen mucha potencia para ordenar y encontrar datos cuando se usan correctamente. Cuanto más pueda agregar durante la adquisición, mejor. Al agregar, asegúrese de ser consistente con las convenciones de nomenclatura, un espacio adicional, una letra mayúscula omitida puede cambiar la reunión de la palabra clave.

Asistente de compensación.

La literatura está llena de magos famosos: Merlín, Gandalf y Dumbledore, por nombrar algunos. En citometría de flujo, también tenemos un famoso asistente: «Asistente de compensación.»El poder de este asistente es identificar los controles de compensación, activar automáticamente las poblaciones positivas y negativas y calcular una matriz de compensación.

FJX tiene un asistente tan potente y cuando introduce datos en el FJX, puede agregar tubos automáticamente al grupo de compensación. Esto se hace a través de palabras clave! En preferencias, el usuario puede definir palabras clave específicas que se utilizan en sus experimentos para definir los tubos de compensación. El valor predeterminado se muestra a continuación.

Figura 6: Palabras clave de compensación

Cualquier archivo que tenga un borrador o no esté manchado en la palabra clave F FIL se asigna al grupo de compensación.

Un problema con esto, es que el uso de $FIL sin manchas puede conducir el análisis por el camino de usar un negativo universal, y eso viola la 2a regla de compensación, así que tómese un momento para editar esta configuración para evitarlo.

Al seleccionar el grupo de compensación, el Icono de compensación ya está disponible. Antes de presionar el botón, tómese un momento para revisar los tubos en el grupo y agregar o quitar según sea necesario. Dado que la compensación es una propiedad del fluorocromo, no del portador, es fácil mezclar y combinar perlas y células para la compensación, siempre que haya un positivo y un negativo en cada muestra.

Una vez liberado el Asistente de Compensación, pasará por un proceso para identificar el control apropiado para cada detector, identificar el portador del objetivo a través de la dispersión, seguido de las muestras positivas y negativas. A partir de esto, se calculará la matriz de compensación, y tan rápido como se puede decir Aparecium, la matriz completa.

Gráfico 7: La salida del Asistente de compensación

Al extremo izquierdo es un icono rojo / amarillo / verde que indica si hay un problema con el control de compensación. Al pasar el cursor sobre el icono rojo o amarillo aparece el diálogo por qué puede haber un problema con el control.

A continuación se muestra el parámetro y el nombre del control que se utiliza para compensar este parámetro. Más a la izquierda hay un menú desplegable donde se puede cambiar la población, así como las muestras negativas y positivas utilizadas para calcular la compensación.

A continuación se muestra una ventana que muestra los controles negativos y positivos, así como un histograma que muestra la apertura de la muestra negativa y positiva (azul para negativo, verde para positivo). Aquí es donde es importante inspeccionar los controles para asegurarse de que el software realice su magia con precisión.

Gráfico 8: Problemas con el Negativo Universal

Como se muestra arriba, el negativo universal se usó para compensar e inspeccionar la figura central, está claro que hay alguna diferencia en la fluorescencia de fondo entre el pico azul (negativo) y el pico negativo verde. Esto se puede corregir fácilmente haciendo doble clic en el control de un solo color en el extremo derecho, seguido de doble clic en la puerta y convirtiendo la gráfica mostrada en un histograma Ahora es posible agregar una puerta negativa. No olvide seleccionar la nueva población negativa en la ventana de parámetros superiores.

Figura 9: Fallas de Autocomp

Recordando que el control CD3 dio un error, al inspeccionar los datos, está claro que la compuerta de dispersión está significativamente desactivada. Una vez más, haga doble clic y las puertas se pueden editar correctamente.

Si sospecha del asistente, no hay nada que le impida compaginar los datos inicialmente, antes de ejecutar el asistente de compensación, para que pueda seleccionar las puertas adecuadas. Esto es especialmente útil cuando hay eventos súper brillantes en el control de compensación. A menudo se ocultan en el histograma y pueden afectar los cálculos de la matriz. Por lo tanto, el análisis bivariado le permite eliminar estos.

Figura 10: Análisis bivariado para compensación.

Asegúrese de comprobar los resultados de los asistentes para asegurarse de que la matriz de compensación se calcula correctamente con los controles adecuados.

Matriz de propagación de desbordamiento.

Los controles de compensación son útiles para calcular una segunda matriz, la «matriz de propagación de desbordamiento»o » SSM». Este MUS tiene un doble propósito. En primer lugar, puede ayudar a identificar dónde se pueden usar los detectores y fluorocromos para obtener la señal máxima para aquellos objetivos que necesita una alta sensibilidad. En segundo lugar, ayuda a proporcionar control de calidad en y entre los instrumentos.

Después de calcular una matriz de compensación, seleccione el botón «Ver matriz», que abrirá una ventana que muestra la matriz de compensación. A la izquierda, arriba de la matriz de compensación, habrá una opción SSM. Seleccionar eso le permitirá mostrar o exportar el SSM.

Figura 11: Dos SSM de dos instrumentos diferentes

Exportar la matriz como cvs permite importar los datos en software como Excel, como se muestra arriba. En la Figura 11, se comparan dos instrumentos diferentes basados en los mismos fluorocromos. Usando estos datos, es posible determinar qué instrumento puede tener más sensibilidad para un panel dado

El SSM es una gran herramienta para comprender los problemas potenciales con los instrumentos y mejorar el diseño del panel, y es fácil adquirir esta información.

FlowJo y R.

En los últimos 10 años ha habido una proliferación de paquetes de análisis de citometría de flujo escritos en software como R. Estos paquetes a menudo agregan algunas capacidades de análisis interesantes y emocionantes para los datos, pero si no es fácil con R, tratar de usarlos puede ser desalentador.

FlowJo ha creado lo que ellos llaman el portal de FlowJo y una forma para que usted pueda traer scripts R a FlowJo. Es una herramienta muy útil.

Figura 12: Intercambio de FlowJo.

Para aprovechar estos complementos, deberá instalar el programa R (gratuito) y asegurarse de apuntar a FlowJo a donde está, lo que se hace en la ventana de preferencias, debajo de diagnósticos. También debe apuntar el software a la carpeta de complementos. Esto te permitirá usar herramientas como SPACE, tSNE, FlowSom y más.

Mi favorito es FlowAI, y esa herramienta limpia automáticamente los datos buscando anomalías y genera una puerta buena y una mala. Esta es una forma más avanzada de crear una puerta de estabilidad de flujo’

Figura 13: Salida FlowAI

Como se puede ver aquí, aquí hay un problema muy obvio con los datos, que se pueden eliminar, pero FlowAI identifica algunas regiones más que tienen problemas. La razón por la que esto es importante es que estos datos pueden aumentar la propagación de las poblaciones de interés, reduciendo la sensibilidad del análisis.

Tómese un tiempo para agregar estos nuevos complementos a su FJX y explore cómo estas herramientas pueden ayudar a mejorar la consistencia y reproducibilidad de sus datos.

Crear tablas en FlowJo.

Finalmente, después del análisis de las muestras, necesitamos extraer datos importantes (% de población, intensidades fluorescentes medianas, etc.) de las poblaciones objetivo. Esto puede ser tan fácil como arrastrar las poblaciones de interés al editor de tablas. Esto es relativamente rápido de hacer, pero da como resultado nombres muy largos en el archivo de salida, como se muestra a continuación.

Figura 14: Nombres largos en las salidas de la tabla.

En la tabla hay una 4a columna con la etiqueta nombre. Al ingresar un nombre más corto y memorable en esta columna, cuando se genera la tabla,

Figura 15: El uso de nombres mejora las etiquetas de la tabla.

Otra característica de la tabla FJX es la capacidad de crear una fórmula, como el índice de tinción, y tenerla como otra columna a exportar.

Figura 16: Fórmulas en FJX.

Al cambiar el nombre de las columnas, hace que escribir estas fórmulas sea fácil. FJX también aparecerá un diálogo rojo debajo de la ecuación hasta que sea correcto, así que vigílalo.

Figura 17: Índice de tinción calculado en FJX

Aquí hay otro truco que se puede hacer en la ventana de la tabla: Es posible graficar los datos seleccionando las dos filas para que sean los ejes X e Y. Esta salida intenta ajustar los datos a una línea de regresión, pero es una forma rápida de asegurarse de que sus datos se vean razonables antes de continuar.

FlowJo es una poderosa herramienta para realizar y analizar experimentos de citometría de flujo si sabe cómo usarlo al máximo. Esto incluye comprender la incrustación y el uso de palabras clave, el asistente de compensación de FlowJo, la matriz de propagación de desbordamiento, FlowJo y R, y la creación de tablas en FlowJo. Extender su uso de FJ utilizando estos hacks le ayudará a organizar sus datos, mejorar el análisis y hacer que sus datos exportados sean más fáciles de entender y explicar a los demás. Tómese unos momentos y explore todo lo que puede hacer con FJ, más allá de las poblaciones de puertas abiertas.

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