5 Hacks FlowJo Pour Améliorer La Qualité De Votre Analyse de Cytométrie en flux

L’analyse des données primaires, c’est-à-dire l’analyse au niveau de l’échantillon ou du tube, est l’endroit où les populations d’intérêt sont identifiées et où les données nécessaires sont extraites pour l’analyse secondaire. Depuis la création de la norme FCS, les cytométristes en flux ont la possibilité d’analyser des données dans des logiciels tiers en raison de l’accord de la communauté sur la norme. La norme la plus récente de FCS3.1. La norme FCS divise le fichier en deux composants, le fichier listmode qui contient les données séquentielles de tous les détecteurs. Le fichier d’en-tête contient ce qu’on appelle des « mots clés ». Il s’agit notamment de définir des mots clés qui sont ajoutés automatiquement au fichier, ainsi que des termes qui peuvent être définis par l’utilisateur.

Ces mots clés ne sont que la pointe de l’iceberg lorsqu’il s’agit d’effectuer des analyses avancées. Cet article se concentrera sur la puissance de FlowJoX (FJX) et fournira quelques trucs et astuces pour améliorer l’analyse des chercheurs.

Intégration et utilisation de mots clés.

Les informations d’en-tête du fichier FCS contiennent de nombreuses informations très utiles à examiner et à extraire lors du contrôle de la qualité ou du dépannage. Cette information n’est qu’à un clic droit dans FJX.

Figure 1: Accès aux informations d’en-tête FCS dans FJX

La sortie de cette action est illustrée à la figure 2.

Figure 2: Informations sur le fichier d’en-tête.

À gauche se trouve une liste de tous les mots-clés qui se trouvent dans le fichier, de l’instrument sur lequel les données ont été acquises à qui les a acquises et plus encore. Tous les mots clés définis sur mesure apparaîtront également ici. En fait, il est fortement encouragé à ajouter des mots clés lors de la configuration de l’acquisition de fichiers sur l’instrument. De cette façon, vous êtes assuré que les mots clés corrects sont reportés. Cela peut être très utile pour trier et analyser les données ultérieurement.

En haut à droite se trouve une liste des paramètres, y compris la tension à laquelle chaque paramètre a été exécuté. Enfin, le bas à droite présente un graphique de la médiane de chaque paramètre au fil du temps, ce qui est utile pour identifier s’il y a eu des problèmes majeurs dans l’acquisition, mais plus à ce sujet plus tard.

Si vous n’avez pas ajouté de mots clés au début de votre expérience, ne désespérez pas. Vous pouvez toujours ajouter facilement des mots-clés dans FJX en utilisant l’option Mot-clé, qui se trouve sur le ruban FlowJo, comme le montre la figure 3

Figure 3 : Ajout de mots clés lors de l’analyse.

Dans cet exemple, nous ajoutons le mot-clé concentration à ce fichier contenant les données de titrage. Après avoir sélectionné ‘OK, le mot-clé est ajouté et apparaîtra dans l’exemple d’espace de travail où vous pourrez renseigner le mot-clé approprié. Des mots-clés peuvent également être ajoutés au ruban de l’espace de travail, ce qui vous permet également de créer une série de valeurs de mots-clés, facilitant ainsi l’étiquetage du mot-clé. Les résultats de l’ajout des valeurs de concentration en tant que nouveau mot-clé sont présentés à la figure 4.

Figure 4: Concentration ajoutée à l’aide du mot clé.

Une chose courante avec les données de titrage est la génération d’un fichier concaténé de toutes les données afin qu’elles puissent être affichées sur un seul graphique bivarié. Dans la figure 5, les données ont été triées par concentration, soit de faible à élevée, soit de haute à faible, et les données ont été concaténées.

Figure 5 : Tri des données avant la concaténation.

Étant donné que les données peuvent être triées à l’aide du mot clé, cela permet un tri / organisation complexe des données. . Supposons que vous ayez des mots clés pour la durée du traitement (0 heure, 4 heures, 20 heures), le type de traitement (pas de stim, stim 1, stim 2) et l’échantillon (PBMC, BM), vous pouvez effectuer un tri complexe pour organiser les données de manière à faciliter l’analyse.

Les mots-clés offrent beaucoup de puissance pour trier et trouver des données lorsqu’ils sont utilisés correctement. Plus vous pouvez en ajouter lors de l’acquisition, mieux c’est. Lors de l’ajout, assurez-vous d’être cohérent avec les conventions de nommage, un espace supplémentaire, une majuscule manquée peut changer la réunion du mot-clé.

Assistant de compensation.

La littérature regorge de sorciers célèbres – Merlin, Gandalf et Dumbledore, pour n’en nommer que quelques-uns. En cytométrie de flux, nous avons également un assistant célèbre: « Assistant de compensation. »Le pouvoir de cet assistant est d’identifier les contrôles de compensation, de saisir automatiquement les populations positives et négatives et de calculer une matrice de compensation.

FJX a un assistant si puissant et lorsque vous apportez des données dans le FJX, peut automatiquement ajouter des tubes au groupe de compensation. Cela se fait via des mots clés! Sous préférences, l’utilisateur peut définir des mots clés spécifiques qui sont utilisés dans ses expériences pour définir les tubes de compensation. La valeur par défaut est indiquée ci-dessous.

Figure 6 : Mots-clés de compensation

Tout fichier ayant comp ou non coloré dans le mot-cléFFIL est affecté au groupe de compensation.

Un problème avec cela est que l’utilisation deFFIL unstained peut conduire l’analyse sur le chemin de l’utilisation d’un négatif universel, et cela viole la 2ème règle de compensation, alors prenez un moment pour modifier ce paramètre pour éviter cela.

Lorsque vous sélectionnez le groupe de compensation, l’icône de compensation est maintenant disponible. Avant d’appuyer sur le bouton, prenez un moment pour examiner les tubes du groupe et ajoutez ou retirez si nécessaire. Étant donné que la compensation est une propriété du fluorochrome, et non du support, il est facile de mélanger et d’assortir les perles et les cellules pour la compensation – à condition qu’il y ait un positif et un négatif dans chaque échantillon.

Une fois que l’Assistant de compensation est libéré, il passe par un processus pour identifier le contrôle approprié pour chaque détecteur, identifier la porteuse cible par diffusion suivie des échantillons positifs et négatifs. À partir de là, la matrice de compensation sera calculée, et aussi vite que vous pouvez dire Aparecium, la matrice complète.

Figure 7: La sortie de l’Assistant de compensation

À l’extrême gauche se trouve une icône rouge/jaune/verte qui indique s’il y a un problème avec le contrôle de compensation. En survolant l’icône rouge ou jaune, un dialogue apparaît pour expliquer pourquoi il peut y avoir un problème avec le contrôle.

Vient ensuite le paramètre et le nom du contrôle utilisé pour compenser ce paramètre. Plus à gauche se trouve un menu déroulant où la population peut être modifiée, ainsi que les échantillons négatifs et positifs utilisés pour calculer la compensation.

Ci-dessous se trouve une fenêtre montrant les contrôles négatifs et positifs ainsi qu’un histogramme montrant la grille d’échantillonnage négative et positive (bleu pour négatif, vert pour positif). C’est là qu’il est important d’inspecter les contrôles pour s’assurer que le logiciel a effectué sa magie avec précision.

Figure 8: Problèmes avec le négatif universel

Comme indiqué ci-dessus, le négatif universel a été utilisé pour la compensation et l’inspection de la figure centrale, il est clair qu’il y a une certaine différence de fluorescence de fond entre le pic bleu (négatif) et le pic négatif vert. Cela peut être corrigé assez facilement en double-cliquant sur le contrôle teinté unique à l’extrême droite, puis en double-cliquant sur la porte et en transformant le tracé affiché en histogramme, il est maintenant possible d’ajouter une porte négative. N’oubliez pas de sélectionner la nouvelle population négative dans la fenêtre des paramètres du haut.

Figure 9: Échecs d’Autocomp

Rappelant que le contrôle CD3 a donné une erreur, lors de l’inspection des données, il est clair que le scatter gating est significativement désactivé. Encore une fois, double-cliquez et les portes peuvent être correctement modifiées.

Si vous vous méfiez de l’assistant, rien ne vous empêche de gater les données initialement, avant d’exécuter l’assistant de compensation, afin que vous puissiez sélectionner les portes appropriées. Ceci est particulièrement utile lorsqu’il y a des événements super lumineux dans le contrôle de compensation. Ceux-ci sont souvent cachés dans l’histogramme et peuvent avoir un impact sur les calculs matriciels. Ainsi, l’analyse bivariée vous permet de les supprimer.

Figure 10 : Analyse bivariée de la rémunération.

Assurez-vous de vérifier les résultats de vos assistants pour vous assurer que votre matrice de compensation est correctement calculée à l’aide des contrôles appropriés.

Matrice d’épandage par débordement.

Les contrôles de compensation sont utiles pour calculer une deuxième matrice, la  » matrice d’étalement de débordement » ou  » SSM ». Ce SSM a un double objectif. Tout d’abord, il peut aider à identifier où les détecteurs et les fluorochromes peuvent être utilisés pour obtenir un signal maximal pour les cibles dont vous avez besoin d’une sensibilité élevée. Deuxièmement, il aide à assurer le contrôle de la qualité sur et entre les instruments.

Après avoir calculé une matrice de compensation, sélectionnez le bouton ‘Afficher la matrice’, qui ouvrira une fenêtre montrant la matrice de compensation. Sur la gauche au-dessus de la matrice de compensation se trouvera une option SSM. Sélection qui vous permettra d’afficher ou d’exporter le SSM.

Figure 11: Deux SSM de deux instruments différents

L’exportation de la matrice sous forme de cvs permet d’importer les données dans un logiciel comme Excel, comme indiqué ci-dessus. Sur la figure 11, deux instruments différents sont comparés sur la base des mêmes fluorochromes. En utilisant ces données, il est possible de déterminer quel instrument peut avoir plus de sensibilité pour un panneau donné

Le SSM est un excellent outil pour comprendre les problèmes potentiels avec les instruments et améliorer la conception des panneaux, et il est facile d’acquérir ces informations.

FlowJo et R.

Au cours des 10 dernières années environ, il y a eu une prolifération de paquets d’analyse de cytométrie en flux écrits dans des logiciels comme R. Ces paquets ajoutent souvent des capacités d’analyse intéressantes et passionnantes pour les données, mais si vous n’êtes pas facile avec R, essayer de les utiliser peut être intimidant.

FlowJo a créé ce qu’ils appellent le portail FlowJo et un moyen pour vous d’introduire des scripts R dans FlowJo. C’est un outil vraiment utile.

Figure 12: Échange FlowJo.

Pour profiter de ces plugins, vous devrez installer le programme R (gratuit) et assurez-vous de pointer FlowJo où il se trouve, ce qui se fait dans la fenêtre préférences, sous les diagnostics. Vous devez également pointer le logiciel vers le dossier du plugin. Cela vous permettra d’utiliser des outils tels que SPACE, tSNE, FlowSom et plus encore.

Mon préféré est FlowAI, et cet outil nettoie automatiquement les données en recherchant des anomalies et génère une bonne et une mauvaise porte. C’est un moyen plus avancé de créer une porte de stabilité d’écoulement’

Figure 13: FlowAI output

Comme on peut le voir ici, voici un problème très évident avec les données, qui peuvent être bloquées, mais FlowAI identifie quelques régions supplémentaires qui ont des problèmes. La raison pour laquelle cela est important est que ces données peuvent augmenter la propagation des populations d’intérêt, réduisant la sensibilité de l’analyse.

Prenez le temps d’ajouter ces nouveaux plugins dans votre FJX et d’explorer comment ces outils peuvent aider à améliorer la cohérence et la reproductibilité de vos données.

Création de tables dans FlowJo.

En fin de compte, après analyse des échantillons, nous devons extraire des données importantes (% de population, intensités fluorescentes médianes, etc.) des populations cibles. Cela peut être aussi simple que de faire glisser les populations d’intérêt vers l’éditeur de table. C’est relativement rapide à faire, mais il en résulte des noms très longs dans le fichier de sortie, comme indiqué ci-dessous.

Figure 14: Noms longs dans les sorties de table.

Dans le tableau, il y a une 4ème colonne intitulée nom. En entrant un nom plus court et mémorable dans cette colonne, lorsque la table est générée, le

Figure 15: L’utilisation de noms améliore les étiquettes du tableau.

Une autre caractéristique de la table FJX est la possibilité de créer une formule, comme l’indice de coloration, et de l’avoir comme une autre colonne à exporter.

Figure 16: Formules en FJX.

En renommant les colonnes, cela facilite l’écriture de ces formules. FJX affichera également un dialogue rouge sous l’équation jusqu’à ce qu’il soit correct, alors gardez un œil sur cela.

Figure 17: Indice de coloration calculé en FJX

Voici une autre astuce qui peut être faite dans la fenêtre du tableau: Il est possible de représenter graphiquement les données en sélectionnant les deux lignes pour être les axes X et Y. Cette sortie essaie d’adapter les données à une ligne de régression, mais c’est un moyen rapide de s’assurer que vos données semblent raisonnables avant de continuer.

FlowJo est un outil puissant pour effectuer et analyser des expériences de cytométrie en flux si vous savez l’utiliser au maximum. Cela inclut la compréhension de l’intégration et de l’utilisation de mots clés, l’assistant de compensation FlowJo, la matrice d’étalement de débordement, FlowJo et R, et la création de tables dans FlowJo. Étendre votre utilisation de FJ à l’aide de ces hacks aidera à organiser vos données, à améliorer l’analyse et à rendre vos données exportées plus faciles à comprendre et à expliquer aux autres. Prenez quelques instants et explorez tout ce que vous pouvez faire avec FJ au-delà des populations de déclenchement.

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