호주로부터의 개에서 모기 매개 심장 사상충 디로필라리아 임미티스

샘플

테스트 된 샘플에는 두 개의 코호트가 포함되었습니다. 첫 번째 코호트 샘플은 클리닉 항원 테스트에서 양성 반응을 보인 샘플에서 나왔습니다. 두 번째 코호트 샘플은 시드니 대학교 수의학부에서 현재 개 심장 사상충 치료를받은 최근의 임상 사례에서 나온 것입니다.

2015 년 4 월~6 월에 호주 퀸즈랜드에 있는 개로부터 채취한 혈액 샘플(표 1). 개들은 매카이 지역(1 번,3 번,34 번,36 번,39 번),케언즈(2 번,2 번)및 투 움바(35 번)(추가 파일 1:표 1)에 위치했다. 모든 샘플은 초기에 수의학 종사자에 의해 양성인 개에서 성인 여성 디 이미 티스(심장 웜)항원을 검출하기위한 신속한 면역 이동(림)분석 결과 인 클리닉 증인 디로 필라 리아(호주 조에 티스)를 사용하여 양성 반응을 보였습니다. 2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 각 개에 대해서만 지역,나이,의심되는 심장 사상충 관련 임상 징후의 존재 및 심장 사상충 예방 병력이 가능했습니다. 심장 사상충 예방 준수는 고객이 적절한 제품으로 일년 내내 투여를 지시 한 경우(구매 및 투여에 대한 실제 증거는 제공되지 않음),심장 사상충 예방을 놓치거나 간헐적으로 투여하거나 잘못된 투여 량을 투여 한 경우’일치하지 않음’,그러한 정보를 사용할 수 없거나 알 수없는 경우’알 수 없음’으로’엄격한’것으로보고되었습니다. 이 연구를 위해 시드니 대학교 수의학부에서 처리되었습니다(추가 파일 1:표 1).

표 1 호주의 개에서 심장 사상충(디로 필라 리아 임미 티스)에 대한 진단 요약

두 개의 최근(2016 년 2 월)마이크로 필라 리아 양성 개 혈액 샘플은 시드니 대학 수의학 교육 병원,시드니 대학 수의학 학부에 의해 제공되었습니다. 두 개 모두 이전에 호주 퀸즐랜드에 거주했습니다. 또한,본 발명의 실시예에 따라,마이크로필라리아 농도는 마이크로모세포를 사용하여 평가하였다. 간단히 말해서,버피 코트는 에타 혈액의 원심 분리 후 마이크로 헤마 토크릿 튜브에서 현미경 하에서 마이크로 필라 리아의 존재에 대해 관찰되었다. 또한 수정 된 노트의 테스트로 양성 반응을 평가했습니다. 2.0 테스트 키트(바이오노트,라이프 바이오사이언스,오클리,호주)를 사용하여 혈액을 채취하여 양성 반응을 보였다.; 개는 뉴 사우스 웨일즈 주 시드니에 도착하기 전에 퀸즐랜드 주 맥케이에 머물 렀습니다. 2.0 테스트 키트;개는 브리즈번,퀸즐랜드 출신 이었지만 퀸즐랜드의 다른 곳(출처 알 수 없음)에서 재배포되었습니다. 심장 사상충 예방은 간헐적으로 진행되었습니다. 또한,2009 년부터 피지 나디에 거주하는 개로부터 격리 된 개 유전자가 초기 양성 대조군으로 연구에 포함되었습니다.2510>

개 혈액의 분리 및 확인 2510>

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개 혈액의 분리 및 확인 2510>

본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면, 격리는 11 개의 혈액 샘플 및 추출 블랭크의 배치로 처리되었습니다. 초기 용해는 백혈구 용해 단계(650 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 적혈구 용 해물 및 450 마이크로바이옴 키트 프로토콜에 의해 제안된 바와 같이,킹피셔 마이크로타이터 딥 웰 96 플레이트에서 700 마이크로바이옴 상청액으로 처리되었다. 시료를 70%의 물(70%)에 용출하였다. Genomic DNA 에서 샘플 FVS-CN#1FVS-CN#6,고립되었을 사용하여 분리하 II 혈액 DNA Kit(BioLine,호주)그리고 용출에 100µl Tris buffer(pH=8)의 제조업체의 프로토콜입니다. 나노 드롭 1000 분광 광도계(열 피셔 과학,스콜스비,호주)에 의해 결정되었습니다. 2018 년 11 월 15 일~2018 년 12 월 15 일

원심 분리 후 미세 헤 마토 크릿 튜브에서 투베르쿨린 주사기와 바늘을 사용하여 1-2 마이크로 필라 리아를 가진 버피 코트를 수집 하였다. 물총새의 모비오 키트를 사용하여 유전자를 분리했습니다.2010 년 12 월 25 일(수),2011 년 12 월 25 일(수),2012 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 12 월 25 일(수),2013 년 3 분 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 95 초 동안 15 초 동안 60 초 동안 15 초 동안 40 개의 2 단계 사이클이 포함되었습니다. 100000000000 의 물,그리고 200000000000 의 물,그리고 200000000000 의 물,그리고 200000000000 의 물,그리고 200000000000 의 물,그리고 20000000000 의 물. Real-time PCR 에 진행되었습니다 CFX96 터치™Real-Time PCR 탐지 시스템과 함께 해당 CFX Manager v.3.1 소프트웨어(된,랜 코브 국립 공,Australia). 임의의 실시간 회로 기판 임계값은 보고된 기본 설정 및 코네티컷 값을 사용하여 자동으로 결정되었습니다.본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예는,본 발명의 실시예에 따른 실시예의 실시예에 의해 결정된다. 혈액 샘플에서 디로 필라 리아 임 마티스,브루 지아 말레이 및 비 파 한기의 검출을 위해. 본 발명은 미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로,미토콘드리아 유전자에 관한 것으로, 분석실험은 잠재적으로 모든 사상충 선충 종 증폭 가능합니다. Real-time PCR 반응 혼합물(20µl)포함되어 있 10µl 의 SensiFAST HRM 혼합(Bioline),각각의 프라이머를 400nM 농도,4.4µl 의 PCR 급 물,그리고 4μl 의 DNA template. 유전자에 대한 양성 대조군 플라스미드는 유전자에 의해 합성되었다(열 피셔 과학,스콜스비,호주).

을 최적화 조건과 함께 SensiFAST HRM 혼합(BioLine,오스트레일리아),실시간 PCR 효율성 평가에서는 열 그라데이션에서 59°C62°C 에 대한 ten-fold 시리얼 희석제(에 이르기까지 1.96×105 1.반응 당 96,000 복사본 100 복사본)을 포함하는 플라스미드 유전자의 알려진 농도의. 반응의 조건들을 설정과 처음 효소 활성화 단계에 95°C 이를 위해 3 분에 의해 다음 40 두 단계 사이클에 95°C for5s59°C62°C15s. HRM 사이클 설정이 60°C,90°C,단위에서 0.2°C 간격으로. Real-time PCR 에 진행되었습니다 CFX96 터치™Real-Time PCR 탐지 시스템과 함께 해당 CFX Manager v.3.1 소프트웨어(된,Australia). 각 샘플에 대한1 보고 코네티컷-값과 양의 컨트롤의 표준 곡선을 기반으로 번호를 복사합니다. 이 임계 값은 100 에서 단일 임계 값으로 설정되었습니다. 온도 증가 함께 형광을 감소의 정규화 된 곡선을 플롯 정밀 용융 소프트웨어 절 1.2(바이오 라 드,호주)사용 되었다. 각 실행에는 적어도 하나의 음수(비 목표 제어)제어가 포함되었습니다.2510>

상기와 같이 최적화 된 필라 라리 12 초 르르나 유전자 실시간 회로망은 어닐링 온도를 62 로 설정하여 반응 효율(90-110%)과 검출 한계가 크거나 같다고 판단 됨 12 초 르르나 유전자의 196 유전자 복사본 반응 당.2510>

또한,혈액 샘플의 미세 필라 리아 농도를 정량화하는 데 사용되었으며,각 샘플에 대해 미세 필라 리아로의 전환을 보정하는 데 사용되었습니다(추가 파일 1:표 1). 이 두 가지 방법은 다음과 같습니다. 정반대 플라스미드). 모든 유전자 샘플은 한 번 실행되었습니다. 아니오 또는>35 캐럿 값(각각 음수 샘플 및 후기 증폭기)이 반환되면 반응이 다시 실행되었습니다. 마크로젠에서 증폭 프라이머를 사용한<35 캐럿 값을 가진 모든 샘플을 디엔에이티 정제 및 후속 디엔에이티 시퀀싱을 위해 전송하였다. (서울,한국). 정규화 된 용융 곡선 및 차이 용융 곡선을 생성하기 위해 사전(70-71)및 사후(76-77)용융 정규화 영역이 정규화 및 차이 플롯의 주요 온도 경계를 정의하도록 설정되었습니다. 정밀 용융 소프트웨어 절.1.2 그런 다음 기본 설정을 사용하여 각 샘플을 클러스터에 할당합니다.

디로필라리아 임미티스 특이 적 실시간 회로분석

리쉬누 등에 의해 설계된 프라이머를 사용하여 디 임미티스의 검출을 위한 실시간 회로분석을 수행하였다. 그리고 로하스 등의 알에 의해 적용. . 본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면,본 발명의 실시예에 의하면, 상기 반응 혼합물은 10 개의 센시파스트 시브르 노록스 키트(바이올린,오스트레일리아),각 프라이머 400 나노미터 농도의,4.4 다.4.4 다.4.4 다.4.4 다.4.4 다.4 다.4 다.4 다.4 다.4 다.5 다.5 다.5 다.5 다.6 다.6 다.6 다.6 다.6 다.7 다.7 다.7 다.7 다.7 다.7 다.물 먼저,감응식 시브르 노록스 키트(호주 바이올린)를 사용하여 프라이머 쌍에 대한 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 59 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 62 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 63 제 상기 반응은 3 중 10 배 연속 희석(1.96 반응 당 102 내지 1.96 반응 당 107 카피)을 포함하는 플라스미드 유전자의 공지 된 농도로 실행되었다. 유전자에 의해 합성 된 임티스 콕스 1 유전자(써모 피셔,호주)및 음성(템플릿 없음)제어. 증폭은 다음과 같이 수행되었다:95 에서 초기 변성 단계 3 분 동안,변성 40 사이클(95 에서 5 초),어닐링(59 에서 15 초~62 초)이 뒤를이었다. 최종 용융 곡선은 생성물을 0.5 초 단위로 5 초 동안 60 초에서 90 초까지 가열함으로써 생성되었다. 2015 년 11 월 15 일-2015 년 11 월 15 일-2015 년 11 월 15 일,호주). 2015 년 11 월 15 일(토)~2015 년 11 월 15 일(일)~2015 년 11 월 15 일(일) 62 의 어닐링 온도는 최적의 것으로 밝혀졌고 후속 증폭 반응에 사용되었습니다.

최종 최적화 된 실시간 회로실행은 감도를 평가하기 위해 플라스미드(1.96 107~1.96 반응 당 102 카피)의 추가 중복 10 배 연속 희석을 갖는 샘플-템플렛 제어 및 비 표적 제어로 구성되었다. 반응 효율(90-110%)및 검출 한계는 반응 당 196 콕스 1 유전자 복사본으로 결정되었습니다. 분석 효율을 평가하기 위해 표준 곡선이 생성되었습니다. 마크로젠(주)에서 유전자 정제 및 염기서열분석을 위해 샘플이 전송되었습니다. (서울,한국).본 발명은 당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화,당단백질 궤적 서열의 특성화, 그 결과,우리는 혈액에서 직접 분리 된 유전자를 사용했습니다. 혈액에서 분리 된 유전자의 전체 게놈 증폭 단계를 사용 합니다. 전체 게놈 증폭(WGA)를 사용하여 수행됩 illustra GenomiPhi V2DNA 증폭 장비(GE 건강 관리,파라마타,오스트레일리아)사용하는 1µl 의도록 설계되었에서 추출된 개 혈액입니다. 우리는 주로 심장 사상충 예방제(표 1)에 대한 엄격한 준수가 보고된 유전자 샘플에 초점을 맞추었다. 또한,본 발명의 실시예에 따라,상기 제 1 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라, 모든 PCR 증폭되었을 사용하여 수행 MyTaq™빨간색 조합(BioLine,Australia). 프라이머를 각각 0.25 의 최종 농도로 첨가 하였다. 최종 반응의 볼륨 25µl 을 위한 첫 번째 PCR 실행되었을 사용하여 다음과 같은 사이클 조건:95°C 에 15 초,56°C for5s,72°C 에 15 초 35 사이클과 2μl 의 격리 DNA 또는 2μl1:50 의 희석 GenomiPhi 증폭 DNA. 모든 반응은 95 에서 5 분 동안 시작되었고 72 에서 5 분 동안 종료되었다. 의 pcr 들었에서 실행 Veriti PCR 자전거 타는 사람(생명과학,Australia)과 함께 멸균 PCR 급 물 부정적으로 제어합니다. 생성 된 생성물은 1.5%(승/승)아가로 오스 겔에서 해결되었다. 의 pcr 들었에서 실행 Veriti PCR 자전거 타는 사람(생명과학,Australia)과 함께 멸균 PCR 급 물 부정적으로 제어합니다. 생성 된 생성물은 1.5%(승/승)아가로 오스 겔에서 해결되었다. 마크로젠(주)에서 증폭 프라이머를 사용하여 직접 시퀀싱했습니다. (서울,한국). 또한,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따른 실시예에 따라,

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